抗体药物偶联物（Antibody Drug Conjugates,ADC）是将单克隆抗体和强效高毒性小分子药物通过连接子偶联形成，能够靶向地使小分子药物在目标癌细胞发挥效应，由于其治疗效果突出，已经成为发展最快的癌症治疗手段之一。根据Grandview数据，随着ADC药物陆续上市，同时适应症拓展到更多疾病领域，ADC药物的行业规模未来将保持快速增长，预计2025年市场规模将达到210亿美元，2020-2025年复合增速将超过50%。

　　分子排阻色谱（SEC）

　　SEC是基于不同蛋白质分子尺寸来实现分离，通常需要高离子强度的水溶液作为流动相来屏蔽分子与固定相之间的作用力，可用于对ADC药物分子量、表观分子量分析，是研究分子大小异变体最常用的方法。由于ADC偶联的小分子通常具有较高的疏水性，如果采用单克隆抗体SEC分析的流动相来分析ADC药物，其SEC结果峰型变宽、分辨率较差，可以通过在流动相中添加少量有机溶剂来改善SEC结果，如乙腈、异丙醇等有机溶剂。此外，流动相中的离子类型也会对SEC分离ADC药物结果产生影响。

　　疏水作用色谱（HIC）

　　疏水作用色谱基于不同蛋白质分子与固定相之间疏水作用的强弱来实现分离，在分离过程中蛋白样品保持其天然构象，是一种典型的非变性分析方法，是计算ADC药物DAR值、计算未偶联抗体分子比例的有效方法。流动相是否添加有机溶剂、有机溶剂的浓度梯度选择以及固定相的性质对HIC分离效果影响较大。以上市ADC药物Kadcyla为例，HIC分离过程中有机溶剂的添加量对不同DAR值ADC分子的出峰时间和峰型都有较大影响，并且会影响最终DAR值计算。流动相B中有机溶剂异丙醇（或乙腈）含量在18%时可以较好的区分不同DAR值ADC分子。此外，在分离时将流动相的梯度设置为对数梯度相较于经常使用的线性梯度会有更好的分离度。这是由于偶联药物小分子数量较少时，小分子药物偶联数量的增加对ADC药物的疏水性影响较大，而DAR值为6与8的两种不同ADC分子其疏水性变化相对较小，因此需要有机溶剂浓度梯度较小以实现更好的分离效果。

　　反向液相色谱（RPLC）

　　RPLC与HIC相似，其对蛋白质分离都是基于蛋白质分子与固定相之间的疏水作用，区别在于RPLC的固定相通常具有更强的疏水性。相对于HIC在分析ADC药物时对样品不进行前处理，采用RPLC对ADC药物进行分析前通常使用TECP或DTT对ADC进行还原以获得更高的分辨率并以此进行ADC药物DAR值、偶联位置等关键质量属性分析（CriticalQualityAttribution,CQA）。RPLC在采用Cys或定点偶联策略的ADC药物分析中应用广泛。对于采用定点偶联的几种ADC药物可通过其RPLC结果得到其偶联位点分别为（a）和重链（b），并且其DAR值为2。对于采取Cys随机偶联的ADC药物，可通过与十二烷基硫酸钠毛细管电泳（CE-SDS）结果对比得到其具体半胱氨酸偶联位点。