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生物学研究离不开分析蛋白质的组成及含量变化

来源:英格尔医药科技中心 发布时间:2019-08-23

  蛋白质和生命活动有什么相关吗,蛋白质是生命活动的直接执行者,生物学研究离不开分析蛋白质的组成及含量变化。目前研究样本中蛋白质的含量都是间接方法:


  1.基于抗体的检测方法,如Westernblotting、ELISA。这些方法的可靠性、灵敏度非常依赖于抗体的质量。对那些没有商业化的抗体的蛋白而言,无法用这些方法分析蛋白含量变化。


  2.通过基因表达的变化预测蛋白质含量变化,但是mRNA和蛋白含量之间相关性并并不强,导致结果经常出现偏差。


  那么,有没有一种方法无需通过抗体、或者转录水平这些间接的方法,而是能够之间分析样品中的含量呢?答案是肯定的,这种方法就是我们要介绍的蛋白质组技术。按照实验目的可以将蛋白质组技术分为两大类:高通量蛋白质组学和靶向蛋白质组学,分别用于前期的差异蛋白筛选以及后续的目标蛋白验证。例如针对临床Biomarker的筛选,通常是首先应从有限数目的临床样本中使用高通量的方法筛选出差异的目标蛋白,然后使用靶向蛋白组技术针对目标蛋白进行扩大样本的验证,如下图1:

生物学研究离不开分析蛋白质的组成及含量变化


  高通量蛋白质组和靶向蛋白质组分别有各自不同的技术体系,以下对其主要的技术方法和特点做一个简要介绍:


  1.高通量蛋白质组,主要使用的DDA(DataDependentAcquisition)技术体系。DDA是基于鸟枪法(shotgun)的原理,因为生物样品中蛋白质复杂程度极高,仪器不可能做到全部信号的采集,因此只能在每一个检测循环中优先采集相对较强的信号。这种方法有两个局限性:第一,对于低强度的信号无法有效采集,限制了检测的灵敏度;第二,检测中“较高的信号”是一个相对的概念,不同样品甚至不同批次的上机不可避免地产生一定的随机性。


  2.靶向蛋白质组技术,顾名思义是只选取和检测目标蛋白相关的信号,忽略其他无关的信号,因此可以实现对目标蛋白定量的高特异性和高准确性。如果我们将常用的高通量蛋白质组技术方法理解为霰弹枪,那么靶向蛋白质组技术就是狙击枪(图2)。

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  靶向蛋白质组技术主要包括SRM/MRM和PRM两种方法。SRM/MRM(Selected/Multiplereactionmonitoring)使用的是三重四级杆的质谱,利用四级杆高选择性的特点对母离子和子离子依次进行分选,该技术在2012年的在NatureMethods中有详细的总结论述1,并被评为年度技术(MethodoftheYear2012),可见其重要意义和应用价值。在SRM/MRM的基础上,2012年晚些时候,在MCP上报道了新型的靶向蛋白组技术——PRM(Parallelreactionmonitoring)技术2,该技术结合了四级杆的高选择性以及Orbitrap的高分辨、高精度特性,能够对二级图谱进行独立的鉴定,方法流程更加便捷(图3)。与传统的SRM/MRM相比,PRM在复杂背景下具有更好的抗干扰能力和检测灵敏度(图4)。因此,PRM是更具优势和潜力的新型靶向蛋白质组检测方法,堪称SRM/MRM的升级版。

生物学研究离不开分析蛋白质的组成及含量变化

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  PRM相比WB方法的优势


  以上我们介绍了靶向蛋白质组的技术原理和特点。那么,靶向蛋白质组技术和传统的基于免疫的方法(WB、ELISA)相比有什么优势呢?我们将二者的比较总结为以下的表格:


生物学研究离不开分析蛋白质的组成及含量变化


  PRM应用举例


  PRM因为具有精确的鉴定和定量能力,现在已经广泛应用与生命科学研究中,以下是一些例子:


  1,普渡大学的研究者在PNAS上发表了通过血液外泌体寻找癌症相关biomarkers的研究。研究人员高通量蛋白质组技术寻找出差异蛋白的磷酸化位点,然后使用了PRM的方法进行扩大样本的验证3,如下图5,可以看出的确这四个潜在的biomarker在病人和健康人群体中有显著的分布差异。


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  2,在植物研究领域中,常常因为缺乏商业化的抗体而阻碍了研究的深入。而PRM技术的出现无疑是植物科研工作者的福音。2014年JPR上的一篇报道使用了PRM的方法来研究植物信号调节过程中的蛋白质降解的现象4,如下图6,可以看到针对FLS2的两条uniquepeptide的PRM定量结果是非常一致的,这表明针对这个蛋白的定量结果高度可信。


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  实验流程


  作为蛋白质组检测服务的领军企业,景杰生物(PTM,Bio.Inc)现已正式开通靶向蛋白质组PRM的检测服务,结合高通量蛋白质组和修饰组检测技术,能够给大家的科研提供更全面的服务与支持。PRM检测的基本流程包括:


  在可行性评估阶段,我们将依据现有数据和文献报道等进行预先的评估,有效的评估是后续实验成功的重要保障。之后,我们会通过实验和分析进行相应的方法学建立,然后开展正式的PRM检测。具体方法流程可以咨询我们的业务人员。


  


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